counting:식품면역학실험레포트 (2)MTT assay&cell

 

1. Introduction

1.1MTT assay 원리

-MTT는 4.5-디메틸디아졸-2-일-2,5-데페닐테라졸륨프로미드로 담황색을 띠는 물질입니다. 세포의 증식 및 성장과 사멸도 등의 세포 활성을 측정하는 MTT assay에 사용됩니다. 또한 이 방법은 식품의 기능성 성분과 다양한 생리활성물질이 세포에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구에 널리 응용되고 있습니다.

- MTT 분석은 살아있는 세포인 미토콘드리아의 탈수소 효소에 기반하여 이 효소에 의해 황색 수용성 MTT 테트라졸름, tetrazolium의 ring 구조가 끊어진 청자색을 띠는 비수용성 MTT formazan으로 환원되고 청자색의 불용성 MTT 포마잔으로 변화하는 원리를 이용합니다./이때 생성된 포마잔의 양과 앞으로 보이는 청자색 세기가 세포의 생존율에 비례합니다. 따라서 노란색이 많으면 세포가 힘이 없어지거나 죽거나 하므로, 미토콘드리아의 활성이 멈추어 탈수소 효소가 정상적으로 작동하지 않아 MTT를 포마잔으로 바꿀 수 없었다고 이해하면 됩니다. 반대로 청자색이 많이 보이면 생생하게 살아있는 세포인 탈수소나제가 일을 했다는 의미로 해석될 수 있습니다. 이후 생성된 포마잔의 흡광도를 측정하여 세포의 성장과 사멸도에 대한 정확한 수치를 얻을 수 있습니다.

1.2 마지막에 DMSO를 넣는 이유

MTT 포머잔은 불용성 물질로 세포 내에 축적되는데, 이때 DMSO는 유기 용매이기 때문에 세포막을 파괴하고 이를 용해시킨 뒤 세포 내에 있는 결정을 세포 밖으로 추출할 수 있게 하는 역할을 합니다.

- 위와 같은 역할이므로 DMSO대신 NaOH나 sodium dodecylsulfate, Triton X-100과 같은 계면활성제를 포함하는 혼합액으로 사용할 수도 있습니다. - 결과는 흡광광도계를 이용하여 빛의 투과성을 보고 얼마나 MTT가 Formazan으로 바뀌었는지 확인하는데, 이때 결정된 부분이 있으면 빛의 투과성에서 정도를 확인할수록 오류가 생길 가능성이 높습니다. 따라서 이 결정을 액체상태로 녹여 오류를 최소화할 목적으로도 DMSO를 사용합니다.

2. Material

2.1 MTT assay RAW264.7 cellculturedin96-wellcultureplate Micropipette & tip Multipette Incubator Microscope Waste통 Foil Microplatereader 2DShaker Centrifuge MTTreagent (5mg/mL) DMSO

2.2 cell counting HT-29 cell resuspension Hemocytometer Cover slip Micropipette & tips Microscope 96 well plate PBS Complete DMEMTrypan blue Clue

 

3. Method

3.1MTT assay 1.96-well plate에 RAW264.7 cells를 2x10^5 cells/mL로 seeding하여 약 18시간 배양한다.(total volume 200μL) 2. 배양 후 배지를 모두 제거하고 C-DMEM에 희석한 whey를 농도별로 처리한다.3. Incubator(37 ℃. CO2)에서 24시간 배양한다. 4. 각 well에서 Supernatant를 110μL 제거하고 90uL만 남긴다.5. 실험실의 불을 끄고 MT Treagent를 최종 농도가 0.5mg/mL가 되도록 10μL를 각 well에 넣는다. (avoid light) 6. Incubator에서 2~4시간 동안 빛을 차단하여 incubation한다. (호일로 plate 감싸고 진행) 7. 중간에 색상 변화를 현미경으로 확인하여 보라색 결정 형태를 확인한다.8. Centrifugation(2000rpm, 5min, RT)으로 celldown(생략)9. 상등액을 제거한 후 DMSO100μL을 넣고 2Dshake에서 약 10분 dark bluecrystal을 용해시킨다.10.Microplater eader에 의해서 570 nm 로 O.D 를 측정한다.

3.2 cell counting1. Hemocytometer의 chamber와 coverslip을 ethanol을 이용하여 닦는다.2.96-well plate의 well에 각각 A와 B로 표시한 뒤, Awell에 40μL의 PBS를 분주한 후, cellsuspension액을 10μL분주한다.3. Awell을 pipetting 한 후, Awell액을 10μL 취하여 Bwell에 분주하다.4. Bwell에 trypan blue 10μL을 분주한 후. Bwell의 10μL을 hemocytometer에 분주하다. 현미경에 hemocytometer를 실어 cell counting을 진행한다.5. Viablecells를 counting한다. (viableseenas bright, non-viablestained blue) 6. Viablecells의 concentration을 계산한다.

4. Results4.1 MTT assay

먼저 제2조의 결과값을 보면 whey의 첨가율로 인해 생존율의 일정한 변화를 볼 수 없습니다. 0.1보다 아무것도 첨가하지 않은 NT의 생존율이 약간 높은데, 1, 10 정도의 첨가율이 NT 값보다 높기 때문입니다. 따라서 해석을 하면 적은 양인 0.1을 첨가하는 것보다는 처음부터 넣지 않거나 1에서 10정도의 양을 첨가하면 세포에 좋다는 것을 알 수 있습니다. (+이러한 해석은 고찰에 적어 주십시오! 그리고 다른 실험적 요인들에 의해 마치 세포 목성이 존재하는 것처럼 보이기 때문에 이러한 해석은 좋지 않습니다라고 코멘트됨)

결과를 도출하는데 비교 대상이 많지 않아 1조와 2조의 값을 모두 가지고 그래프를 만들어 본 결과, 2조의 단독 결과와는 약간 다른 모습을 보였습니다. 위는 1조와 2조의 결과를 모두 합친 값입니다. 이 결과를 보면 NT 값과 나머지 값 사이의 일정한 변화나 큰 차이가 없으면 실험이 잘못되었거나 whey의 청가 또는 첨가율이 큰 의미가 없다고 해석할 수 있습니다.

4.2 cell counting

회원끼리 한 부분씩 깎은 아주고 세고 합친 숫자가 144이었습니다. 그 후(144/4)*2*10^4을 한 뒤 과학적 표기법으로 바꾸어 7.2*10^5가 나왔습니다.

5. Discussion5.1 MTT assay.

-세포의 사멸 정도로 육안으로도 미세한 빛깔의 차이를 구분할 수 있고 또 작은 한 plate내에 다양한 well을 통하여 다양한 조건에서 실험을 하고 바로 옆에서 비교하자는 것이 매우 효율적인 방법이라고 생각했다.

-MTT가 빛에 약한 시약이라 항상 은박지에 싸서 사용하여 전기를 끄는 등 최대한 빛에 맞지 않도록 하면서 실험을 실시했습니다. 그러나 가장 강력하고 직접적인 빛인 현미경으로 관찰할 때 직접 해당하는 불에 의해서 영향을 받지 않을까 생각하게 되었습니다. 그러나 이는 관찰을 위해서는 어쩔 수 없는 부분이므로 가급적 밝기를 조정하고 관찰하는 것이 좋은 시간적 여유가 있으면 2~4시간 방치이어서 2시간 후에 확인하고 1시간 후에 확인하기보다는 처음부터 4시간 가까운 시간에 확인하고 현미경의 빛에 쬐는 시간을 줄이는 것도 괜찮다고 생각했습니다.-MTTassay할 때 96-well에 세포를 seeding하기 전에 cellcounting을 통해서 적절한 양의 세포 수가 있는지 확인하고, 많으면 희석되면서 적은 경우는 그대로 사용하는 방식으로 세포 수를 일정하게 조절하고 실험을 시작하면 실험 결과에 오류가 발생하지 않습니다.

-실험에 사용한 RAW264.7cell은 부착형 세포이므로 well의 바닥에 달라붙어 자랍니다. 실험 초반에 cell을 키운 뒤 왜 고급 즙을 취하고 버릴 때 세포가 붙어 못 위에 있는 배지 또는 whey만 제거할 수 있습니다.

-96-wellplate에서 실험을 하는 것은 처음이었지만, 매스가 생각보다 너무 좁아 각 well사이의 간격이 좁아 고급 액을 제거하는 데 전체 plate를 기울이고 바닥에 달라붙지 않도록 담벼락에 대거나, 중간 파이 펫의 첨단을 넣어 빨아들이기에도 아직 익숙하지 않기 때문에, 아래의 세포를 긁거나 손상을 입혔습니다. 파이 펫의 길이가 긴 것도 아닌데 정확하게 미세하게 수면이 내려가는 것에 의해서 함께 조금씩 내려가며 들이마셔야 되지 않지만 파이 펫이 익숙하지 않고 well의 바닥에 닿아 세포가 계속 붙어 있어야 하는데 가끔 난 부분이 고급 액을 모두 제거하고 DMSO을 넣기 전에 확인하고 보니 육안으로도 확인되었습니다. 우리 반 실험에 오차가 있으면 그 부분이 가장 크게 작용했을 것입니다. 게다가 남김없이, 농도 다른 사람이 했으니 그 정도가 다르고 실험 결과가 더 정확하지 않다고 생각합니다. 점점 숙련도를 높이고 가서(숨을 참고하거나)시간이 걸리더라도 지금보다 더 천천히 하면서 정확도를 높여야 한다고 생각합니다. 또 안전하게 더 잘 빨아들이기 때문에 plate를 기울였는데 자꾸 위의 well에 있는 용액이 아래로 흐르는 것 아닐까 무서워서 각도를 크게 기울일 수 없었습니다. 다음부터는 안전한 범위 내에서 더 기울이고 실험을 합니다.

정해진 것을 현미경으로 확인했을 때 세포가 포도송이처럼 굳어진 것과 비슷한 크기로, 세포의 포도송이 근처에 꽤 많은 양이 정해져있는 것을 발견했습니다. 따라서 DMSO로 확실하게 녹이지 않으면 결과에 오류가 생길 수 있기 때문에 정확하게 녹이는 것이 중요하다고 생각했습니다.

- 실험에 대해서 좀 더 조사를 해보았는데, formazandye의 최대 흡광도는 540nm 부근으로 나타났습니다. 또한 세포의 생리적 상태나 세포의 종류에 따라 미토콘드리아탈수소효소 활성의 차이를 보이는 것을 알 수 있었습니다. 그리고 처음 상등액을 섭취할 때 부착형 세포라 비교적 간단했다고 느꼈는데, 이 방법은 suspension cell에 적용하기 어려운 단정도 있다는 것을 알게 되었습니다. 그러나 비교적 간편하고 정확하게 세포성장 및 사멸도 변화를 평가할 수 있을 뿐만 아니라 multi-well plate를 사용하여 많은 양의 시료를 동시에 측정할 수 있어 in vitro 상에서의 세포활성을 평가하는데 널리 사용되고 있다고 합니다.

5.2 cell counting

- 다른 조와 같은 well 예가 있는 세포를 이용하여 이론적으로는 모두 같은 값이 나와야 하는데, 각 조마다 세포 개수가 다른 이유는 모두 실험에서 발생한 오차가 합쳐져서 발생한 것 같습니다.

-우선 사용한 세포는 HT-29로 부유 세포가 아닌 부착형 세포입니다. 따라서 같은 장소에서 떼어내어 희석했다 하더라도 세포가 용액 전체에 균일하지 못했을 확률이 높습니다. 또 희석하는 과정 또 파이 페팅 과정에서 세포가 손상되었을 수 있습니다

- 두 번째는 hemocytometer 사용과정에서 일어난 적이 있습니다. 수직으로 떨어뜨린다고 생각했는데, 측면에서 파이펫을 선택하는 형태로 고정시키고, 한꺼번에 축과 내뱉는 방법으로 hemocytometer안에 세포를 떨어뜨리는 방법이었습니다. 이 과정에서 기포가 생기면 안 되는데, 저희 조의 경우는 너무 세게 눌러서 기포가 생겼어요. 이런부분에서오차가발생했다고생각합니다.

마지막 카운트입니다 카운트를 할 때 지금 보고 있는 셀이 센지 안 센지 엄청 헷갈렸어요. 한 사람이 한 구역을 세는데도 오차가 생길 위험이 그렇게 큰데 실험에 참가한 모두가 각기 다른 구역을 세었기 때문에 적게 혹은 더 세었을 것입니다. 이것은저같은경우에는눈금을보고가로방향으로한줄씩빨리속력을올리는방식으로해결했습니다. 그러자 현기증이 나는데도 불구하고 두 번이나 확인을 했는데도 차이가 없었기 때문입니다.

6. References - 김주형, 홍종일. (2018). 빛, 용매와 zinc protoporphyrin에 의한 MTT 포마잔의 화학적 동태 변화. 한국식품과학회지 50(1). 1-7. - 박경아 최현아 김미리 최유미 김현정 홍종일. (2011). MTT for mazan의 발색에 미치는 zinc protop or phyrin의 영향. 한국식품과학회지 43(6). 754-759. 감사합니다.